正常情况下,以双通道为例,曝光时间30ms, 一边拍以便进行实时重构,拍摄10000帧需要8--10min左右。如果先拍照后分析,曝光时间10ms为例,拍摄10000帧需要1min40s左右。
样品最好是染色完成后,及时进行拍照,样本来不及拍照可以避光保存在4℃,保存时间不超过3天。
由于力显智能科技的iSTORM产品所具备的20nm超高分辨率、2-3通道同时成像、界面友好、简单易用、系统稳定性好、环境适应性高等综合特点和优势,使得它能够帮助到更多科学家进行衍射极限尺度以下的生物分子组织与相互作用等的尖端科学研究,已为包括香港科技大学、香港大学、中山大学、深圳大学、北京大学医学院等在内等超过50家科研小组和100位科研人员的科学研究的提供帮助,并获得了高度认可。
iSTORM技术采用在特定成像缓冲液中具有光切换特性的有机染料。理论上,与激光器波长兼容的光切换染料均适用。但是,用户应该严格测试染料的光切换特性,例如染料在成像缓冲液中的亮/暗工作周期。每个周期释放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切换次数越多的染料越合适。本手册中提供的样品制备方案均采用Alexa FluorÒ 647 和Alexa FluorÒ 750这一对荧光染料,这是目前最适合iSTORM双通道成像系统的选择。如果实验仅需要观察一个目标(即单通道),Alexa FluorÒ 647是首选,因为相比Alexa FluorÒ 750,Alexa FluorÒ 647 每个切换周期释放出更多的光子,且具有更短的工作周期。
此外,诸如蓝色吸收染料(Atto 488、Alexa 488、Atto 520)、黄色吸收染料Cy3B、红色吸收染料(Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto680)和近红外吸收Alexa 750等染料也都可以用来超高成像。
对生物结构进行特异性标记可通过免疫染色(直接免疫染色法或间接免疫染色法)且以光切换染料标记,也可以通过多肽或酶体(例如商业化产品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等)标记目标蛋白。
适用于iSTORM系统的二抗已经商业化且已被广泛使用。用户也可以考虑对一抗、FAB片段或者纳米抗体进行荧光标记,由于荧光分子距离目标蛋白更近,所以蛋白定位相比间接免疫荧光标记法更加准确。
iSTORM超高分辨率显微镜主要适用于实验室、研究所及医院的实验与观察。样品广泛适用于分子细胞生物学、神经生物学、免疫学、药理学等领域内固定的细胞、组织、细菌、酵母和病毒的研究,iSTORM活细胞版也可以进行活细胞的相关成像。
荧光染料被激发进入发射态,之后会进入暗态(Dark state),在暗态中它们将与自由氧结合,进入漂白状态。在漂白状态下,染料不会再次发出荧光。如果不让染料与自由氧结合,它将无法进入漂白状态,一直维持在暗态。高功率的激发光可以使染料从暗态再次进入发射态。这种从亮到暗再到亮的状态切换看起来就像是染料在“闪烁”一样。STORM通过随机的分批“点亮”目标分子来进行超分辨定位。这样每个活跃的荧光集团都被分辨,它们的图像与其他分子分开,不重叠。这样确定了基团的准确位置,多次重复这个过程,每次随机打开荧光基团的不同亚基,得到图像,确定每个亚基的位置后,把以上图像重建成一张超高分辨率图像。
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